DLS 方法開(kāi)發(fā)和驗證（下）

1.  方法驗證

分析方法驗證是證明分析程序適合其預期目的的過(guò)程⁵。并非所有驗證特征都適用于粒度分析。較早的 FDA 工業(yè)指南（非實(shí)施）草案文7包括一個(gè)專(zhuān)門(mén)針對粒度分析的部分。盡管較新的已發(fā)布文件取代了較舊的指南草案，但有關(guān)粒度分析的較舊部分提供了有關(guān)粒度分析與其他技術(shù)（如 HPLC）的不同之處的見(jiàn)解。舊文檔中的以下聲明有助于方法驗證工作：

“方法驗證通常涉及中間精度和重復性的評估。應保證生成的數據是可重復的，并控制產(chǎn)品的質(zhì)量。"⁷

考慮到這一評論，下面提供了解決 DLS 方法驗證的建議：

● 特異性：N/A，DLS 檢測大小變化但對不同化學(xué)物質(zhì)不敏感。

● 線(xiàn)性：N/A，DLS 沒(méi)有任何線(xiàn)性關(guān)系。

● 準確性：N/A，儀器的準確性使用標準粒子進(jìn)行驗證，但常規定量裁判方法（SEM/TEM 顯微鏡）不包括準確性確定。包括樣品的 SEM/TEM 圖像以支持方法驗證可能是更合適的。

● 精密度（重復性、中間精密度和重現性）：這是需要重點(diǎn)關(guān)注的地方。通常這些術(shù)語(yǔ)的定義在粒度分析領(lǐng)域可能不同于其他技術(shù)。以下評論來(lái)自粒度分析領(lǐng)域：

    重復性：多次測量樣品。

    重現性：準備樣品、測量、丟棄、清潔、重復。建議的方法是制備五份樣品，然后對每個(gè)樣品進(jìn)行五次分析。

    中間精密度：此活動(dòng)涉及第二位分析員、第二臺儀器或兩者兼而有之。如果所有測試都在一個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行，則由同一系統上的不同操作員在不同日期分析同一批次的樣品。如果要在多個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行測試，則同一樣本（或批次）由不同操作員在不同地點(diǎn)的不同系統上進(jìn)行分析。

● 范圍：N/A，僅在所用系統的工作范圍內工作。無(wú)需對此進(jìn)行測試或記錄。

● 定量限：N/A，這只是測試粒徑。

● 檢測限：N/A，方法開(kāi)發(fā)應確保樣品在系統檢測限內。

2.  結構示例

兩名操作員在兩個(gè) Nicomp DLS 系統上分析了一種藥物物質(zhì)（異丙酚乳劑）。該樣品已過(guò)期，但仍顯示符合 USP<729>的合格結果。儀器設置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3.  方法開(kāi)發(fā)

首先分析 92 nm PSL 標準以確保適當的系統性能。測量結果在預期值的 98% 以?xún)?。建議在開(kāi)始此類(lèi)工作之前進(jìn)行此驗證測試。

接下來(lái)進(jìn)行快速研究以測試濃度（稀釋?zhuān)┑挠绊?。參?jiàn)圖 1 中的結果。

遵循這些指南的內容，DLS 規格（根據定義尺寸小于 10 µm）對于強度平均值可以是可重復的 ±20%，對于 PI 或其他計算結果指示分布寬度是可重復的 ±30%。對于某些藥品，這可能是一個(gè)可以接受的范圍，但要注意當粒徑非常小時(shí)出現的統計問(wèn)題。如果平均粒徑為 500 nm，±20%，則范圍為 400 – 600 nm，這還不錯。但對于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì)，范圍則為 8-12 nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰且難以接受。

將 10 滴樣品加入 15 mL 去離子水中并進(jìn)行分析。重復相同的制備。然后將這些樣品按 2:1 稀釋并進(jìn)行分析。樣品看起來(lái)太渾濁，結果發(fā)生變化，因此將下一滴添加到 15 mL DI 水中。樣品出現輕微混濁，這些結果是可以接受的。有時(shí)，稀鹽溶液是比純去離子水更好的稀釋劑。下一步是將一滴樣品加入 10 mL 過(guò)濾后的 10 mM KCl 溶液中。這些結果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他測量。

在進(jìn)行稀釋研究時(shí)，分析時(shí)間也從3分鐘到10分鐘不等。三分鐘、五分鐘和十分鐘分析時(shí)間的時(shí)間曲線(xiàn)圖如圖2-4所示。紅色=光強粒徑平均值，藍色=體積粒徑平均值，藍色=數量粒徑平均值。

該方法選擇了5分鐘的分析時(shí)間。在五分鐘的分析時(shí)間完成之前，光強平均粒徑結果已經(jīng)穩定下來(lái)。但直到大約9分鐘前，體積和數量加權平均結果仍在變化。這是也是在使用DLS時(shí)僅選擇光強粒徑結果的一個(gè)原因。這可能是方法開(kāi)發(fā)中測試重復性很好的一個(gè)點(diǎn)。在這種情況下，也許下一個(gè)測試的分析時(shí)間是四分半、五分和五分半鐘。在這項研究中沒(méi)有執行這一步驟，值得指出的是，整個(gè)方法開(kāi)發(fā)和驗證研究在不到8個(gè)小時(shí)內完成。更嚴格的最終發(fā)布測試方法開(kāi)發(fā)和驗證方法很可能需要至少幾天時(shí)間。

4.  樣品準備

——在干凈的瓶子里裝滿(mǎn)10毫升過(guò)濾后的KCl溶液

——用針頭注射器取出0.5毫升異丙酚

——在瓶子里注入1滴異丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋轉直到混合(10秒)

——用一次性移液管將400μL樣品移入圓形一次性玻璃樣品池

——將玻璃樣品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打開(kāi)樣品蓋

——將樣品池和支架插入Nicomp系統，Holder支架背向Nicomp的左側

——關(guān)閉Nicomp上的樣品蓋

確保儀器設置與如下所示的值匹配：

——單擊綠色“G"圖標開(kāi)始測量

——打印并記錄平均直徑、標準偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——將結果輸入 Excel 電子表格

——計算五項分析的平均值和變異系數

——比較兩個(gè)數據集

5.  結果

樣品在 A 和 B 系統上獨立制備和分析。每個(gè)樣品分析五次以檢查重復性。這兩個(gè)系統的示例結果如圖 5 和圖 6 所示。

整個(gè)結果以表格形式顯示在圖 7 和圖 8 中。五個(gè)結果的疊加如圖所示。

6.  結論

查看綜合結果可以得出以下幾點(diǎn)觀(guān)察結果：

——即使是相隔數年生產(chǎn)的兩個(gè)系統也會(huì )生成相似的數據

——兩個(gè)系統之間存在明顯的 3% 偏差

——PI計算可能不是用于定義寬度分布的最佳值

——如果使用PI，則30%的差值似乎是合適的

——D10、D50、D90 結果顯示出更好的重現性，可能更容易為制藥行業(yè)所接受

純粹基于該數據集，基于三個(gè)測量的該藥物產(chǎn)品的規格可能類(lèi)似于：

——光強平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建議規格僅來(lái)自觀(guān)察到的重現性，可能對藥物安全性或有效性沒(méi)有任何影響。USP<729>中的實(shí)際是否通過(guò)標準的要求只是粒徑尺寸必須低于 500 nm 并且具有低x2值。質(zhì)量標準的另一種方法可能是關(guān)注影響有效性和/或安全性的粒徑大小。本技術(shù)說(shuō)明收集的數據是讓您了解 DLS 技術(shù)對于簡(jiǎn)單樣品的可重復性/重現性

7.  儀器介紹

參考資料

1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)

3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation